牛胚胎移植技術詳解（牛受精卵移植技術）

[導讀]牛胚胎移植技術是將優良遺傳性狀的母牛和公牛交配后的早期胚胎取出，移植到另1頭生理狀態相同的母牛子宮內，使其繼續發育直到分娩。充分發揮了優秀母牛的遺傳和繁殖潛力，大大增加了優秀母牛的群體數量。

胚胎移植也叫受精卵移植，是將優良遺傳性狀的母牛和公牛交配后的早期胚胎取出，移植到另1頭生理狀態相同的母牛子宮內，使其繼續發育直到分娩。提供胚胎的母牛稱為供體，接受胚胎的母牛稱為受體。

胚胎移植技術主要包括供體牛的選擇及飼養管理，超數排卵，人工授精，胚胎采集和質量鑒定，受體的選擇及飼養管理，受體的同期發情和胚胎移植等環節。

該技術是繼人工授精之后，牛繁殖技術的又一次革命，充分發揮了優秀母牛的遺傳和繁殖潛力，大大增加了優秀母牛的群體數量。

我國牛胚胎移植研究和應用已有30多年的歷史，已作為一項產業化技術在養牛業中廣泛應用，為我國黃牛改良工作做出了重要貢獻。

一、供、受體肉牛的選擇

供體牛要有較高的生產性能，品種特征明顯，體型外貌良好，遺傳性能穩定，系譜清楚。

受體母牛一般選擇本地黃牛、雜交牛及低產奶牛。供體牛年齡1.5～8歲為宜，從超排效果和便于沖胚考慮，最好選擇1～1胎經產母牛。受體應選擇年齡在8歲以內的性成熟母牛，青年母牛要選擇體成熟并且體格較大的。

供、受體母牛都要求健康無病，繁殖機能正常，沒有流產史，產后60天以上，發情周期正常。直腸檢查子宮及卵巢發育正常，無生殖系統疾病。

母牛體格較大、膘情中等以上、性情溫順。長期空懷、子宮頸狹窄等不得作供、受體母牛。

二、飼養管理

營養是影響母牛繁殖能力的主要因素，供、受體牛都要加強飼養管理，保證足夠的優質青粗飼料、精料以及維生素、礦物質等，保證清潔飲水。

農村散養牛，可采取集中統一管理方式（1-2個月），加強飼養管理。

三、供體牛超數排卵處理方法

超排藥品主要有促卵泡素( FSH)、氯前列烯醇(PG)或陰道栓(CIDR)等。超排過程中供體母牛在發情后的第9～13天，連續4天早晚間隔12小時肌肉注射FSH，在注射FSH的第3天用PG處理。

在實際應用時，一般是同時處理多頭供體和受體母牛，為達到同期化，常采用以下兩種方法。

兩次PG+FSH法：

以國產PG和FSH為例，供體母牛在第1次肌肉注射4毫升PG后，問隔10天再次注射4毫升PG。在第2次肌肉注射PG后的第14天開始進行超排處理。

FSH采用遞減法連續4天早晚間隔12小時進行注射，4天注射量分別70國際單位/70國際單位、60國際單位/60國際單位、50國際單位/50國際單位、40國際單位/40國際單位，總量為440國際單位。在注射FSH的第3天，同時注射PG。注射PG后第2天（注射當天為0天），早晚各輸精1次，第3天視牛的發情狀況，再輸精1次。

CIDR+FSH法：

以進口藥物為例，供體母牛在第1天植入CIDR，在第11天開始注射FSH。采用的是遞減法，連續4天早晚間隔12小時注射，4天注射量分別為4毫升肉牛胚胎移植技術／4毫升、3毫升／3毫升、2毫升／2毫升、l毫升／1毫升。在第3天注射FSH的同時，上下午各注射1.5毫升PG，在第4天上午注射FSH時取出CIDR，注射PG后的第2天（注射當滅為0天）上午、下午各輸精1次。再次輸精與否視母牛的發情狀況而定。

四、沖胚程序

1、沖胚時間：在發情配種后的第7天（發情當天為0天）沖胚，也可在第6天或第8天沖胚。

2、保定與麻醉：供體牛按照人上授精的要求進行保定，并用2%的普魯卡因5 - 10毫升作尾椎硬膜外麻醉。 imuyi.com

3、器械和沖胚液的準備

所有器械必須嚴格按無菌要求進行消毒，在清洗的最后一定要用雙蒸水沖洗，接觸胚胎的器械容器要用沖卵液進行沖洗；沖胚前沖卵液要先預熱（水浴鍋或熱水浸泡）到35 - 37℃。

4、超排效果檢查：在沖胚前，通過直腸檢查卵巢黃體個數，可判斷能沖出的胚胎個數。

5、操作步驟

①用清潔溫水清洗外陰后，用消毒毛巾或衛生紙擦干凈。一般不用消毒藥水，因其使用不當反而會對胚胎造成傷害。

②用擴張棒打開子宮頸通道后退出。

③用沖卵液內外沖洗沖卵管，并檢查氣球是否完好后裝入鋼芯。

④采用直腸把握法將沖卵管插入陰道，通過子宮頸將沖卵管插到一側子宮角（左或右），當到達子宮角大彎部位時，將鋼芯退出約3厘米，并把沖卵管繼續向前推進，如此反復，直到沖卵管前端到達子宮角深部。由助手用注射器沖卵管沖氣孔注入9 - 18毫升（根據子宮角大小確定）空氣使氣球膨脹，堵住子宮角，關閉進氣孔后，將通針取出開始沖胚。

⑤助手用注射器吸取沖卵液，每次15 - 30毫升，從沖卵管L]推入子宮角，注入沖卵液后術者用直腸中的手將子宮角抬高，沖卵液體就會同流，用瓶子接住或直接用注射器回收即可。一般一側子宮角反復沖7次左右。

⑥如需沖另一側子宮角，則按③④⑤重復操作即可。

⑦沖胚時每頭牛用一個容器（瓶子或濾杯）裝回收液，并要注意保溫和避免污染。

6、術后處理

兩側子宮沖卵完畢后，將氣球內的空氣放掉，把沖卵管抽回至子宮體，直接從沖卵管灌注青霉素80萬單位、鏈霉素100萬單位和氯前列烯醇4毫升（用雙蒸水或生理鹽水稀釋）。

五、檢胚

1、檢胚前的準備

檢胚實驗室及各種器具要事先消毒，檢胚的室溫要求是25℃，如果氣溫低要提前進行升溫。

2、過濾法回收

將回收的沖卵液直接注入過濾杯，將過濾杯中留下的35毫升左右回收液倒入平皿中，用沖卵液沖洗過濾杯2-3次，其液體一并沖入平皿中，然后在體視顯微鏡下檢胚。

3、沉淀法回收

回收液靜置20分鐘后用塑料管吸去上清液，在吸時根據虹吸原理進行，要控制（用手握緊或放松出水口）液體的流速，使其緩慢流出，并注意把上面的氣泡吸盡，當吸到液面還有2～2.5厘米深時，將余下的液體倒入兩個培養皿中鏡檢。

4、檢胚

在體視顯微鏡6×1.5倍進行榆胚。用自制的玻璃微吸管（玻璃管拉絲，后面配上一節封口的塑料管）吸取少量培養液將胚胎吸出，移入裝有培養液的平皿中。

六、胚胎的質量鑒定和分級

1、放大倍數

胚胎質量鑒定一般在放大60～200倍體視顯微鏡下進行，如果受體視顯微鏡放大倍數的限制，30倍也行。

2、鑒定依據

在顯微鏡下根據胚胎分裂與否、形態色調、分裂球大小、均勻度、細胞的密度、透明帶以及變性情況等鑒定。

①未受精卵。沒有分裂球及細胞團的卵子。

②桑葚胚。發情后5～6天沖出的卵，只能觀察到球狀的細胞團，分不清分裂球。細胞團占據透明帶內腔的大部分。

③致密桑葚胚。發情后第6～7天回收的卵，細胞團變小，占透明帶內腔的60％ - 70%。

④早期囊胚。發情后第7-8天沖出的卵，細胞的一部分出現發亮的胚泡腔。細胞團占透明內腔的70% - 80%，難以分清內細胞團和滋養層。

⑤囊胚。發情后第7-8天回收的胚胎，內細胞團和滋養層界線清晰，胚泡腔明顯，細胞充滿透明帶內腔。

⑥擴張囊胚。發情后第8-9天回收的胚胎，胚泡腔明顯擴大，體積增大到原來的1.2 -1 5倍，與透明帶之間無空隙，透明帶變薄，相當于正常厚度的1/3。

⑦孵育胚。在發情后第9 - 11天回收的胚胎，由于胚泡腔繼續擴張，致使透明帶破裂，卵細胞脫出。

3、胚胎的分級

沖出的胚胎一般分為A、B、C、D4級。

A級：胚胎形態完整，輪廓清晰呈球形，分裂球大小均勻，結構緊湊，色調和透明度適中，無附著的細胞和液泡。
B級：輪廓清晰，色調及細胞密度良好，可見到一些附著的細胞和液泡。
C級：輪廓不清，色調發暗，結構較松散，游離的細胞或液體較多，變性的細胞達30％ - 50%。
D級：未受精卵、16細胞以下受精卵、有碎片的退化卵及變性細胞超過一半的胚胎。

A級、B級、C級胚胎為可用胚胎，其中，A級、B級為可冷凍胚胎，C級胚胎只能用于鮮胚移植，D級胚胎為不可用胚胎。

七、鮮胚移植

供、受體牛經過同期發情處理，從供體牛獲得的胚胎可以馬卜移植到受體牛的子宮內。

1、受體牛的同期化處理

受體牛的同期化是指其發情時間與供體?；疽恢?，相差時間最好提前一天，受體牛處理頭數一般為供體牛的5倍。

(1)前列腺素法

一次前列腺素(PG)法：在供體牛用前列腺素的前l天，對處于發情周期第10天的受體牛進行直腸檢查，選擇黃體好的受體牛一次肌肉注射前列腺素2～4毫升（按牛體重大?。┱T導發情，發情后第7天進行移植。

二次前列腺素(PG)法：對經直腸檢查空懷的受體牛注射一次前列腺素2-4毫升后11天再次肌肉注射前列腺素2-4毫升，發情后第7天進行移植。

(2)陰道栓加前列腺素(CIDR+PG)法

在供體母牛放入CIDR的第3天，給受體母牛放置CIDR，10天左右取出CIDR，同時肌肉注射PG 4毫升，發情后第7天進行移植。

2、胚胎沖洗

在移植前要對胚胎進行沖洗，方法是在一個培養皿中，分別滴10～12滴培養液，每滴0 l毫升左右，用玻璃微吸管吸入培養液，擠出少量培養液后，按前述的方法從培養液中取出胚胎放入第一滴培養液中，排空吸管，從第二滴培養液中吸入培養液，擠出少量培養液，從第一滴中吸出胚胎放入第二滴培養液中，如此反復直到最后·滴沖洗完畢。

3、裝細管及輸胚器（槍）

用0. 25毫升的塑料細管，先吸入約2厘米長度的培養液，薦吸入l厘米長度的空氣，再吸入胚胎，再吸入空氣，再吸入培養液，細管的兩頭要留有空氣間隔（即7段裝胚法），整個過程用微型注射器吸入。輸胚器的安裝基本與細管精液輸精槍相同，但要特別注意無菌操作，手不能直接觸摸槍帽。裝好后要注意保溫和避免污染，一般用滅菌衛生紙或紗布包裹頭部，并要盡快輸入受體牛子宮。

4、合理搭配受體和胚胎

對受體牛移植時，要考慮胚胎的發育情況和受體的發情時間。一般處于發情第6天的受體牛選用致密桑葚胚移植，處于發情第7天的受體牛選用早期囊胚移植，處于發情第8天的受體牛選用囊胚或擴張囊胚移植。

5、輸胚

受體牛有兩種來源，一是用同期化處理的受體牛，二是根據自然發情記錄來確定。不管是哪一種方法在輸胚前都必須確定受體牛處于發情周期的第7天(6 -8天)，并通過直腸檢查卵巢上是否有明顯的黃體存在，只有明確了黃體的存在并發育正常，才能進行輸胚，而且胚胎必須輸在有黃體一側的子宮角深處。操作方法基本同人工授精，不同的是輸胚的部位在有黃體側的子宮角深部。要盡量減少對子宮的刺激，避免子宮受傷，操作最好在3分鐘內完成。

八、胚胎冷凍與解凍

一般在專門生產胚胎或進行鮮胚移植獲得的可用胚多于受體牛時可將胚胎冷凍保存。下面以乙二醇為冷凍保護液的冷凍過程如下。

1、裝管萬法

將沖洗過的胚胎裝入0. 25毫升的細管中。過程如下：用微型注射器連接細管，吸入約2.5厘米保存液-0.5厘米空氣-0.5厘米冷凍液-0.5厘米空氣一含一枚胚胎的冷凍液-0.5厘米空氣-0.5厘米冷凍液-0.5厘米宅氣一適量保存液，最后用細管封口塞封口。一般要制作一個標簽，注明胚胎系譜、冷凍方法、胚胎發育期及級別等。

2、冷凍程序

用白動或半自動胚胎冷凍儀進行胚胎冷凍。程序如下：將胚胎冷凍儀的冷凍室預冷至5.5℃（植冰溫度），將裝有胚胎的細管放入冷凍室平衡5 -10分鐘，植冰，再平衡5- 10分鐘，然后以每分鐘0.3℃的降溫速度降溫至-32℃，平衡10分鐘后，將細管投入液氮保存。

3、凍胚解凍

用乙二醇為冷凍保護液制作的冷凍胚胎，解凍后可直接移植。解凍程序是：從液氮中取出裝有胚胎的細管一置于空氣中10秒一放入35℃溫水中10秒一滅菌棉擦干一擰下細管塞一裝入移植槍。

九、妊娠診斷

在受體牛接受移植后2個月，通過直腸檢查法判斷是否妊娠。

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